2014-04-15

Нуклеїнові кислоти

3.4444444444444 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Рейтинг 3.44 (9 голосів)

Нуклеїнові кислоти

Нуклеїнові кислоти – це найважливіші біополімери, відповідальні за зберігання і передачу генетичної інформації в живій клітині.

Існують два різних типи нуклеїнових кислот - дезоксирибонуклеїнові кислоти (ДНК) і рибонуклеїнові рислоти (РНК). ДНК – це генетичний матеріал більшості організмів. У прокаріотичних клітинах, крім основної хромосомної ДНК, часто зустрічаються позахромосомні ДНК – плазміди. В еукаріотичних клітинах основна маса ДНК розташована в клітинному ядрі, де вона зв’язана з білками в хромосомах. Еукаріотичні клітини містять ДНК також в різних органелах (мітохондріях, хлоропластах). Що стосується РНК, то а клітинах є матричні РНК (мРНК), рибосомні РНК (рРНК), транспортні РНК (тРНК) і ряд інших. Крім того, РНК входять до складу багатьох вірусів.

Нуклеїнові кислоти: історія дослідження

До середини 19 століття було встановлено, що здатність до успадкування ознак визначається матеріалом клітинного ядра. У 1869 р. Ф. Мішер, досліджуючи хімічний склад ядер гнійних клітин, виділив з них речовину кислого характеру, яку назвав нуклеїном. Ця подія розцінюється зараз як відкриття нуклеїнових кислот. Сам термін «нуклеїнові кислоти» був введений в 1889 році, а в 1891 році німецький біохімік А. Кессель описав гідроліз нуклеїнової кислоти, встановивши, що вона складається із залишків цукру, фосфорної кислоти і чотирьох гетероциклічних основ, які належать до пуринів і піримідинів. Він же вперше вказав на існування двох типів нуклеїнових кислот.

З початку 20 століття почалося інтенсивне вивчення продуктів розщеплення нуклеїнових кислот. Е. Фішер вніс великий внесок в хімію пуринів і піримідинів, а пізніше Ф. Левен, Д. Гулланд та інші визначили будову вуглеводних компонентів і природу нуклеозидних ланок (назви «нуклеозид» і «нуклеотид» були запропоновані ще в 1908-1909 рр.). Остаточно будова нуклеозидів, нуклеотидів і роль фосфодиефірного зв’язку були з’ясовані в 1952 році в результаті робіт англійської школи під керівництвом А. Тодда.

Стосовно полімерної природи нуклеїнових кислот, то з кінця 30-х років існувало переконання, що ДНК – це тетрануклеотид з чотирма різними гетероциклічними основами. Це дозволило пізніше сформулювати тетрануклеотидну теорію будови ДНК. Теорія була спростована лише в 1950 році завдяки роботам Е. Чаргафа, який при ретельному аналізі знайшов значні відмінності в нуклеотидному складі ДНК з різних джерел. Він же сформулював правила про попарну еквівалентність вмісту аденіну і тиміну, гуаніну і цитозину в ДНК. Піонерські роботи з вивчення хімічного складу ДНК рослин були виконані в цей період А. Н. Білозерьским і його співробітниками.

Накопичені дані дозволили сформулювати концепцію: генетична інформація в полімерного ланцюга ДНК міститься в порядку чергування чотирьох мономерних ланок. До цього часу в лабораторії М. Уїлкінса (Р. Франклін) були отримані перші рентгенограми ДНК. Вінцем досліджень будови нуклеїнових кислот стала модель подвійної спіралі ДНК, запропонована в 1953 році Дж Уотсоном і Ф. Кріком, поява якої ознаменувала народження молекулярної біології.

До початку 40-х років були отримані прямі докази участі нуклеїнових кислот у передачі генетичної інформації. У 1940 році Дж. Бідл і Е. Тейтем, ґрунтуючись на численних експериментальних даних з вивчення мутантних штамів хлібної цвілі Neurospora crassa, сформулювали важливий принцип «один ген – один фермент». Дещо пізніше О. Ейвері, К. Мак-Леод і М. Мак-Карті однозначно встановили, що передача спадкової інформації від клітини до клітини здійснюється ДНК.

Ідея самовідтворення, або реплікація, ДНК, що витікала з моделі Уотсона-Кріка, була підтверджена відкриттям ферменту ДНК-полімерази.

Початок робіт, який привів до з’ясування біологічної ролі РНК, було покладено Т. Касперсоном і Ж. Браше ще в 30-х роках 20 століття. Значно пізніше (а 50-х роках) було показано, що синтез білка здійснюється рибосомами, але концепція про існування РНК-посередника (мРНК), що переносить інформацію від ДНК до рибосом, була сформульована Ф. Жакобом і Ж. Моно тільки в 1961 р. Головний фермент транскрипції – ДНК-залежна РНК-полімераза – був відкритий в 1960 р. С. Вейссом, Ж. Гурвіцем і О. Стівенсом.

Одним з найважливіших етапів у вивченні функції нуклеїнових кислот стало розшифрування способу запису інформації в ДНК і принцип передачі її на білкову структуру, тобто формування генетичного коду. У 1961 році Ф. Крік і С. Бреннер показали, що кожній амінокислоті в білку відповідає триплет нуклеотидів. До цього часу були вже виявлені транспортні та з’ясована їхня функція. Сам же генетичний код був встановлений в 1966 році завдяки роботам М. Ніренберга, Г. Корани і С. Очоа.

З моменту відкриття генетичного коду починається новий етап у вивченні структури і функції нуклеїнових кислот. Він характеризується стрімким накопиченням величезної кількості експериментальний даних, які привели до нових якісних уявлень.

До 1970 року дослідження так званої системи рестрикції та модифікації, яка існує в прокаріотичних клітинах і оберігає від попадання всередину клітини чужорідної генетичної інформації, привели до виділення першого з ферментів, які здійснюють рестрикцію. Ним виявилася ендонуклеаза, яка розщеплює ДНК за певною послідовністю основ. Потім було знайдено близько 400 подібних ферментів, здатних відрізняти понад 90 різних послідовностей в ДНК.

Таким чином, з’явився метод специфічних розщеплень молекул ДНК, який склав основу сучасної методології встановлення структури нуклеїнових кислот та генної інженерії.

У 1970 році американські вчені Г. Темін і Д. Балтімор повідомили про відкриття у віріонах опухолеродних РНК-вірусів ферменту – зворотної транскриптази, що здатен синтезувати ДНК, використовуючи РНК як матрицю. Це відкриття стало справжньою революцією у фундаментальних уявленнях про шляхи біосинтезу нуклеїнових кислот і дало можливість отримання in vitro ДНК, які є копіями інформаційних РНК.

У 1972 році П. Берг повідомив про з’єднання in vitro, за допомогою спеціально розроблених прийомів, ДНК двох різних вірусів: бактеріофага λ і SV-40. Таким чином, було покладено початок генетичній інженерії.

Методи генної інженерії в поєднанні з доступністю ДНК, які є копіями мРНК, відкрили три можливості:

  • а) виділення раніше важкодоступних генів еукаріотів в індивідуальному вигляді;
  • б) одержання їх у великих кількостях, необхідних для структурного аналізу;
  • в) створення системи їх експресії в чужорідних організмах, наприклад в бактеріальних клітинах.

Остання обставина відкривала шлях до створення живих організмів із заданими властивостями. Незабаром ця можливість реалізувалася в біотехнології. Були отримані мікроби, здатні продукувати найрізноманітніші білки, зазвичай синтезовані еукаріотичними, в тому числі людськими, організмами.

Дві перші можливості зробили реальним аналіз структури раніше недоступних генів. Бракувало тільки методів швидкого визначення первинної структури великих ДНК.

У 1975 році А. Максам і У. Гілберт в США і Ф. Сенгер у Великобританії розробили такі методи. Вони стали останньою ланкою в ланцюзі методів, необхідних для широкомасштабних досліджень структури та функціонування геномів.

Нуклеїнові кислоти: будова

Первинна структура нуклеїнових кислот

Нуклеїнові кислоти – це біополімери, які складаються з нуклеотидів, з’єднаних фосфодіефірним зв’язком. Кожний нуклеотид складається із залишків гетероциклічної основи, вуглеводу і фосфорної кислоти.

Одним з найважливіших компонентів нуклеїнових кислот є гетероциклічні основи. Всі вони є похідними піримідину або пурину.

У переважній більшості випадків нуклеїнові кислоти в якості гетероциклічних основ містять урацил (тільки в РНК), тимін (тільки в ДНК) і цитозин, які є похідними піримідину, а також аденін і гуанін, що відносяться до похідних пурину.

Нуклеозиди

У складі нуклеїнових кислот гетероциклічні основи зв’язані з D-рибозою в РНК або з 2-дезокси-D-рибозою в ДНК, утворюючи сполуки, названі відповідно рибонуклеозидами або дезоксирибонуклеозидами. Нуклеозиди – це β-N-пентафуранозиди гетероциклічних основ.

Піримідинові основи з’єднуються з вуглеводом своїми N-1, а пуринові – N-9 атомами азоту. Нуклеозиди, що містять аденін і гуанін, називаються аденозином або дезоксиаденозином і гуанозином або дезоксигуанозином. Нуклеозиди – похідні урацилу і цитозину називаються відповідно уридин або дезоксиуридин та цитидин або дезоксицитидин. Дезоксирибопохідну тиміну прийнято називати тимідином, а рібопохідну – риботииідином.

Нуклеотиди

Третій компонент нуклеїнових кислот – ортофосфорна кислота – утворює складноефірний зв’язок зі спиртовими групами рибози або дезоксирибози. Шляхом розщеплення нуклеїнових кислот в контрольованих умовах вдається виділити складні ефіри нуклеозидів і фосфорної кислоти – нуклеотиди. Назви нуклеотидів формуються від назви гетероциклічної основи, що входить до їх складу, з додаванням слова «кислота»: цитидилова кислота, аденілова кислота і т. д.

Важливу роль в життєдіяльності клітини відіграють складні ефіри поліфосфорних кислот і нуклеозидів. Найбільш широко розповсюджені ефіри, утворені ди- або трифосфатними групами і 5’-ОН-групами нуклеозидів. Вони називаються нуклеозидді або нуклеозидтрифосфатами.

Рідкісні (мінорні) компоненти нуклеїнових кислот

Крім основних компонентів, до складу нуклеїнових кислот можуть входити нуклеозиди з незвичайними гетероциклічними основами або з модифікованим вуглеводним залишком.

Рідкісними компонентами ДНК є метиловані основи: 5-метилцитозин, б-N-метиладенін і деякі інші. У ДНК деяких бактеріофагів замість цитозину є 5-гідроксиметилцитозин і його глюкозовані похідні.

РНК також містять рідкісні компоненти. Вони більше зустрічаються в тРНК, менше – в рибосомних і ядерних РНК. Найбільш поширені похідні звичайних основ (цитозину, урацилу, аденіну та гуаніну) із замісниками в гетероциклічному ядрі або в екзоциклічних аміногрупах. Відомі деякі похідні урацилу.

Дуже часто в тРНК зустрічається продукт дезамінування аденозину – інозин.

Оліго- і полінуклеотиди

Олігонуклеотидами називають полімери, в яких кілька нуклеозидів (до 20) з’єднані один з одним фосфодиефірними зв’язками. Довші ланцюги називають полінуклеотидами.

Різні оліго- і полінуклеотиди відрізняються один від одного за вмістом нуклеотидів кожного типу. Виражені у відсотках відносні кількості мономерних ланок називають нуклеотидним складом, а їх послідовність – первинною структурою нуклеїнової кислоти.

При визначення хімічної будови нуклеозидів, нуклеотидів і полінуклеотидів визначаються тип гетероциклічної основи, природа вуглеводного компонента та місце приєднання його до основи, конфігурація глікозидного центру. Встановлюють також число та місце приєднання залишків фосфорної кислоти.

Гетероциклічні основи у складі нуклеїнових кислот ідентифікуються після жорсткого кислотного гідролізу порівнянням їх хроматографічних характеристик, електрофоретичної рухливості, а також УФ-, ІЧ- та ЯМР-спектрів.

Ідентифікація вуглеводних компонентів також проводиться після кислотного гідролізу нуклеїнових кислот. При цьому з пуринових або попередньо гідрованих за 5, 6-подвійним зв’язком піримідинових рібонуклеотидів утворюється D-рибоза. Основи дезоксирибонуклеотидів відщеплюються в значно м’якших умовах, ніж рибонуклеотиди, але внаслідок нестабільності утворена дезоксирибоза перетворюється у левулінову кислоту. При надзвичайно м’якій обробці кислотою пуринових або відновлених піримідинових дезоксирибонуклеотидів вдається виділити дезоксирибозу або її похідні, які легко ідентифікувати.

Спочатку серед нуклеїнових кислот не було виявлено розгалужених структур, що дозволяло вважати їх виключно лінійними полімерами. Проте згодом була показана можливість існування і розгалужених структур РНК.

Визначення первинної структури

Загальні принципи розшифровки первинної структури нуклеїнових кислот ті ж, що і у випадку інших біополімерів. Полінуклеотидний ланцюг розщеплюється за допомогою ферментів і хімічних агентів, що володіють підвищеною селектвністю, на фрагменти, які дешифруються специфічними методами, і потім реконструюється весь ланцюг.

Знання первинної структури нуклеїнових кислот необхідне для з’ясування зв’язку між їх будовою і біологічною функцією і в кінцевому підсумку – для розуміння механізму їх біологічної дії.

Просторова структура нуклеїнових кислот

Якщо мономерною одиницею нуклеїнових кислот вважати нуклеотидну ланку, то для опису її конформації слід враховувати можливість обертання навколо шести зв’язків. Крім того, слід брати до уваги положення основи щодо вуглеводної частини, яке визначається обертанням навколо N-глікозидного зв’язку, і конформаційні зміни фуранозного циклу. Все це робить конформаційний аналіз нуклеїнових кислот вельми складним.

Конформації нуклеїнових кислот

Двоспіральні полінуклеотиди

У більшості випадків ДНК існує у вигляді «подвійної спіралі». Її основні характеристики зводяться до наступного. Дві полідезоксирибонуклеотидні ланцюги з’єднані один з одним за допомогою водневих зв’язків і утворюють правогвинтову спіраль навколо загальної осі. Ланцюги подвійної спіралі антипаралельні і комплементарні, тобто утворення водневих зв’язків (поперечних) завжди відбувається між основами Cі G або А і Т.

Гетероциклічні основи повернені всередину подвійної спіралі, і їх площини приблизно перпендикулярні до її осі. Подвійна спіраль в першому наближенні регулярна, тобто всі її витки мають практично однакові розміри, на кожний виток припадає однакове число пар основ і кожна пара основ повернута відносно іншої на один і той же кут. Із зовнішнього боку спіралі знаходиться гідрофільний вуглеводно-фосфатний залишок.

Комплементарність двох ланцюгів приводить до дуже простого принципу подвоєння генів, або реплікації. Для цього достатньо, щоб ланцюги ДНК розділилися і на кожному з них був синтезований новий комплементарний ланцюг. В результаті утворюються дві дочірні молекули ДНК, ідентичні до вихідної.

Якісного уявлення про структуру ДНК недостатньо для розуміння багатьох спектрів її функціонування, зокрема механізмів взаємодії з білками. Для цього необхідна інформація про деталі структури і можливості її зміни під дією різних факторів.

Циклічні ДНК і суперспіралізація

Багато ДНК з двома ланцюгами в природі є циклічними: плазміди, ДНК мітохондрій і хлоропластів, ДНК багатьох вірусів і бактерій. Такі ДНК, як правило, існують у суперспіральному стані. При цьому подвійна спіраль закручується сама на себе, кількість витків утвореної суперспіралі залежить від зовнішніх умов. Суперспіралізація циклічних ДНК приводить до сильної зміни фізичних властивостей молекули, особливо гідродинамічних і електрофоретичних. У клітинах суперспіралізація здійснюється особливими ферментами, які для бактерій порівняно добре вивчені і називаються ДНК-гіразами (або топоізомеразами II). Інші ферменти – топоізомерази I – можуть зменшувати число супервитків в кільцевих молекулах, даючи набір «ізомерів» з різним числом витків.

Конформації одноланцюгових нуклеїнових кислот

Багато нуклеїнових кислот – більшість РНК і ряд ДНК – існують в одноланцюговій формі. Найбільш добре вивченими одноланцюговими полінуклеотидами є тРНК.

Конформація тРНК

Транспортні РНК виконують в клітинах різноманітні функції. Однак основне їх завдання полягає в здійсненні трансляції. В 1965 році Р. Холлі встановив структуру тРНК з дріжджів. Тоді ж, виходячи з уявлення, що найбільш стабільний стан тРНК відповідає утворенню максимально можливої ​​кількості воднево з’язаних пар основ, а також ґрунтуючись на експериментальних даних щодо нерівномірного гідролізу молекули рибонуклеазами, Р. Холлі запропонував модель вторинної структури тРНК незвичайної форми – з одно- та двохланцюговими ділянками, що чергуються, і назвав цю структуру «лист конюшини».

Структура типу «лист конюшини» пояснювала характерну реакційну здатність нуклеотидних ланок в різних ділянках тРНК у відношенні до хімічних реагентів і до дії рибонуклеаз. Однак гідродинамічні характеристики молекули свідчили про її більш компактну упаковку, яка могла б здійснюватися за рахунок третинної структури. Спосіб утворення третинної структури став зрозумілим після рентгеноструктурного аналізу першої тРНК, яку вдалося отримати в кристалічному. Рентгеноструктурні дослідження були виконані одночасно двома групами. Зрештою були встановлені третинні структури ще декількох тРНК. Третинна структура молекули тРНК нагадує латинську букву L.

Синтез нуклеїнових кислот

В даний час методи синтезу оліго- і полінуклеотидів настільки розвинені, що за короткі терміни можливо отримати штучні фрагменти ДНК великої довжини і практично будь-якого складу. Загальна стратегія синтезу полінуклеотидів і нуклеїнових кислот полягає в комбінованому використанні хімічних та ферментативних методів. Невеликі олігонуклеотиди синтезують хімічно, а потім «з’єднують» в довгі ланцюги за допомогою відповідних ферментів.

Синтетичні оліго- і полінуклеотиди, а також отримані синтетичним шляхом гени і регуляторні області (промотори, термінатори і т. д.) широко використовуються в дослідженні структури та функції нуклеїнових кислот, генетичній та білковій інженерії, біотехнології. Синтез оліго- і полінуклеотидів, - це важливий розділ біоорганічної хімії, який сьогодні має велике теоретичне і прикладне значення.

Ферменти біосинтезу нуклеїнових кислот

У цьому розділі розглядаються основні ферменти біосін ¬ теза нуклеїнових кислот, оскільки багато нз них широко викорис ¬ зуются в хіміко-ферментативному синтезі полінуклеотидів. Серед цих ферментів особливий інтерес представляють полімерази і чи-гази.

ДНК-полімерази

ДНК-полімерази відносяться до типу ферментів, що утворюють фосфодиефірні зв’язки і використовують в якості субстрату дезоксинуклеозидтрифосфати (еМТР). Необхідною умовою роботи таких ферментів, як правило, є наявність матриці і затравки. Матрицею служить одноланцюгова ДНК, і ДНК-полімерази її копіюють, синтезуючи комплементарний полідезоксирибонуклеотидний ланцюг. Синтез не може початися без затравки. Затравка – це оліго- або полінуклеотид, комплементарний матриці і має вільну З’-ОН-групу, з якої починається приєднання першого нуклеотиду новосинтезованого ланцюга.

ДНК-і РНК-лігази

Існують ферменти, здатні з’єднувати між собою фосфодиефірним зв’язком цілі фрагменти ДНК або РНК. Такі ферменти називаються лігазами. З численної родини лігаз найбільше застосування отримали ДНК- і РНК-лігази, які синтезуються в клітинах, інфікованих бактеріофагом Т4.

ДНК-лігаза широко використовується в генній інженерії для з’єднання фрагментів ДНК і при хіміко-ферментативному синтезі ДНК.

РНК-лігази широко використовують для введення мітки в З’-кінцеві ланки РНК.

Хімічний синтез олігонуклеотидів

Ключовою стадією хімічного синтезу олігонуклеотидів є створення фосфодиефірних зв’язків між нуклеотидами. Є два підходи для вирішення цієї задачі. Один із них використовує як джерело фосфатної групи моноетерифіковані фосфати (фосфомоноефіри), а другий – диетерифіковані фосфати (фосфодиефіри).

Хіміко-ферментативний синтез фрагментів ДНК

Комплекс сучасних методів синтезу нуклеїнових кислот дозволяє виходячи з мононуклеотидів отримувати гени, що кодують білки довжиною більше 100 амінокислотних залишків. Першим етапом роботи є хімічний синтез олігодезоксирибонуклеотидів, які потім за допомогою ферментів нуклеїнового обміну перетворюються у двохланцюгові фрагменти ДНК.

З розвитком методів синтезу олігонуклеотидів стало можливим отримувати чисто хімічними способами 30-, 60- і навіть 100-ланкові олігомери. З одного боку, це призвело до спрощення описаної методології (за рахунок істотного скорочення числа лігазних реакцій при збірці гена), а з іншого – створило основу для розробки принципово іншого підходу до отримання синтетичних дуплексів. Такий підхід, запропонований К. Ітакура і співробітниками, полягає у репаратнвній добудові за допомогою ДНК-полімерази E. coli часткового дуплексу, утвореного З’-кінцевими послідовностями двох довгих олігонуклеотидів, в повністю дволанцюжковий фрагмент ДНК. Останній з’єднується в складі векторної молекули з іншим, аналогічно синтезованим дуплексом. Одним з прикладів застосування цього способу є синтез фрагменту гена людського лейкоцитарного інтерферону α2.

Клонування синтетичних полідезоксирибонуклеотидів

Одним із етапів синтезу штучних дволанцюжкових фрагментів ДНК є їх клонування в складі багатокопійного вектора для того, щоб синтезована послідовність зберігалась і при необхідності мога бути напрацьована в достатніх кількостях. З цією метою синтез дволанцюжкових фрагментів здійснюють таким чином, щоб вони містили на кінцях ділянки ідентичні до отримуваних при розщепленні ДНК визначеної рестрикційної ендонуклеази.

Для успішного клонування модулів синтетичного гена на певних ділянках його послідовності повинні міститися відповідні сайти (місця), які розпізнаються ендонуклеазами рестрикції. Ці сайти повинні бути унікальні як для самого гена, так і для вектора, в якому він клонується.

Використання синтетичних оліго- і полінуклеотидів у біоорганічній хімії та біотехнології

Діапазон застосування синтетичних оліго- і полінуклеотидів надзвичайно широкий. Перш за все при вивченні білків нерідко здійснюється синтез відповідних генів і їх фрагментів (якщо число амінокислотних залишків не перевищує 200-250). Шляхом експресії генів за допомогою генноінженерних прийомів отримують значні кількості важкодоступних білків і пептидів, а також їх аналогів.

Однак найбільш широке застосування знаходять порівняно короткі олігонуклеотиди. Для того щоб надати фрагменту нуклеїнової кислоти необхідні для вбудовування в певну ділянку векторної молекули липкі кінці, синтезуються так звану лінкери, тобто дволанцюжкові олігонуклеотиди, що містять послідовність, яка розщеплюється тією чи іншою рестрікційною ендонуклеазою.

За допомогою синтетичних фрагментів ДНК можна модифікувати природні гени, вводячи в них певні зміни. Так, синтетичні олігонуклеотиди були використані для перетворення гена інтерферону людини у форму, придатну для прямої експресії в клітинах E. coli.

Дуже важливим є використання синтетичних олігонуклеотидів в якості гібридизаційних проб (зондів) для пошуку потрібних рекомбінантних колоній в генноінжецерних експериментах.

Особливе місце займає область застосування синтетичних олігонуклеотидів для введення спрямованих змін в структуру гена і потім – у структуру відповідного білка, названа білковою інженерією. Спрямований мутагенез і синтез генів зробили реальним створення білків, що володіють зміненою біологічною активністю, наприклад отримання ферментів з поліпшеними властивостями.

Такі шляхи поліпшення старих і створення нових білків відкривають великі можливості для медицини та біотехнології.

Хімічна модифікація нуклеїнових кислот

Нуклеїнові кислоти – поліфунаціональні сполуки, що містять велику кількість реакційноздатних груп. При дії різних хімічних реагентів в них можуть модифікуватися всі компоненти: гетероциклічні основи, вуглеводні залишки і залишки фосфорної кислоти.

Реакційна здатність мономерних структур у складі полімеру в значній мірі змінюється під впливом просторових факторів. Найбільше значення мають методи селективної модифікації, що широко застосовуються при дослідженні первинної і просторової структури нуклеїнових кислот, введенні штучних мутацій і вивченні зв’язку між будовою і біологічною функцією.

Модифікація гетероциклічних основ

Гетероциклічні основи визначають специфічні властивості нуклеїнових кислот. Їх реакційна здатність у відношенні до різних агентів залежить від природи основи, умов проведення реакції, а для оліго- і полінуклеотидів – вторинної структури відповідної сполуки.

Реакції піримідинових основ з бісульфітом натрію

Бісульфіт-іон здатний зворотно приєднуватися до С(5) – С(6) - подвійних зв’язків цитозину, урацилу і тиміну в м’яких умовах, утворюючи відповідний адукт, нестійкий у випадку тиміну. Практичне значення мають тільки реакції з урацилом і цитозином. Продукти приєднання до урацилу і цитозину досить стабільні у нейтральному та кислому середовищах, але віддають бісульфіт-іон в лужному середовищі.

Реакція бісульфіту з одноланцюговими нуклеїновими кислотами протікає значно повільніше, ніж з мономерами, і практично не йде з двохланцюговими молекулами.

Модифікація нуклеїнових кислот бісульфітом часто використовується як спосіб введення мутаційних замін. З цією метою ділянку ДНК, обрана для введення мутацій, перетворюють на одноланцюгову і потім обробляють бісульфітом в умовах неповного дезамінування.

Реакції з гідразином та гідроксиламіном

Гідразин, його алкільні і ацильні похідні, а також гідроксіламін і його О-алкільні похідні широко застосовуються в дослідженнях нуклеїнових кислот. У водних розчинах при кислих значеннях pH ці реагенти специфічно взаємодіють з похідними цитозину.

У випадку гідразину та його похідних спостерігається лише заміщення аміногрупи, тоді як похідні гідроксиламіну одночасно приєднуються за подвійним зв’язком, утворюючи адукт.

В лужних умовах реакції з гідразином та гідроксиламіном приводять до розщеплення гетероциклічних кілець піримідинів, практично не зачіпаючи пуринових основ.

Окислення

Реакція з OsO4, широко застосовується в органічній хімії для гідроксилювання подвійних зв’язків. Вона дуже добре протікає і у випадку піримідинових основ. Швидкість реакції з тимідином майже на два порядки більша ніж з цитидином і в 10 разів більша ніж з уридином. Тому її можна розглядати як специфічний метод модифікації тимідину.

Галогенування

Одним із поширених методів модифікації основ в нуклеїнових кислотах є галогенування. Реакція протікає різна у водних і безводних середовищах.

Найбільш активні галогенувальні агенти – хлор і бром. При бромуванні (або хлоруванні) похідних нуклеїнових кислот у водних нелужних середовищах відбувається приєднання галогену за С(5) – С(6) подвійним зв’язком кілець піримідину і руйнування гуаніну. Аденозин в цих умовах з галогенами не реагує.

З практичної точки зору важлива реакція йодування нуклеїнових кислот у водних розчинах. При використанні радіоактивного ізотопу йоду вдається отримати мічені полінуклеотиди з високою питомою активністю, які застосовуються в дослідах з гібридизації.

Меркурування

Широко поширена в органічній хімії реакція ненасичених сполук з ацетатом ртуті у випадку нуклеїнових кислот проходить в м’яких умовах (вода, pH 6,0-7,0, 40-50 °С) і специфічна у відношенні до піримідинових основ. Результатом реакції є утворення похідних 5-ацетоксимеркуріоурацилу і 5-ацетоксимеркуріоцитозину.

Алкілування

Реакції алкілування мають велике значення для вивчення нуклеїнових кислот. З одного боку, багато алкілувальних реагентів є мутагенами і канцерогенами, а з іншого боку, реакції алкілування, які проходять в м’яких умовах, широко використовуються для дослідження структури і функцій полінуклеотидів.

Напрямок реакції алкілування визначається природою гетероциклічної основи і умовами експерименту. Гуанінове кільце в нейтральному середовищі алкілується переважно за атомом N(7), а в лужному – за атомом N(1). Вичерпне метилування приводить до 1,7-диметилгуаніну.

У аденіну і його похідних всі три атоми азоту можуть метилюватися, однак швидкість реакції зменшується в ряді N(1)> N(7)> ​​N(3). Єдиним продуктом метилування цитозину є 3-метилцитозин.

Реакції з карбодиімідом

Для дослідження вторинної структури нуклеїнових кислот застосовується реакція основ з похідними карбодиіміду, в результаті якої утворюються відповідні адукти.

З найбільшою швидкістю модифікуються рідкісні компоненти нуклеїнових кислот – інозин і псевдоуридин. Реакція з карбодиімідом практично не йде з двохланцюговими полінуклеотидами. У нуклеїнових кислотах, що містять як двохланцюгові, так і одноланцюгові ділянки, модифікуються тільки останні, що використовується при дослідженнях вторинної структури тРНК.

Ацилування

У реакцію ацилування під дією ангідридів і галогенангідридів органічних кислот вступають як аміно- та іміногрупи, так і гідроксильні групи вуглеводних і фосфатних залишків.

Наприклад, при дії на цитидин бензоїлхлориду в безводному піридині при 100 °С утворюється пентаацилувальні похідні. У м’яких лужних умовах вибірково знімаються бензоїльні групи, зв’язані з гідроксильними групами вуглеводу і атомом N(3), але зберігається бензоїльна група у екзоциклічного атома азоту.

Реакції з альдегідами

Реакція аміногруп гетероциклічних основ нуклеїнових кислот з формальдегідом приводить до утворення амінометилольних сполук. Слід зауважити, що реакція оборотна: при видаленні формальдегіду з реакційної суміші і навіть при її розбавленні спостерігається швидка регенерація вихідних продуктів.

Взаємодія з азотистою кислотою

Аміновмісні основи нуклеїнових кислот при обробці HNO2вступають в реакцію дезамінування. В результаті цього цитозин перетворюється на урацил, аденін – в гіпоксантин, а гуанін – в ксантин.

Модифікація вуглеводних залишків

Вуглеводно-фосфатний кістяк багато в чому визначає конформацію та фізико-хімічні властивості нуклеїнових кислот. Розщеплення нуклеїнових кислот різними ферментами пов’язане зі специфікою будови вуглевод-фосфатного ланцюга: зокрема, багато ферментів відрізняють дезоксирибонуклеїнові кислоти від рибонуклеїнових, кінцеву фосфатну групу від групи, що бере участь в утворенні фосфодиефірних зв’язків, 5’-фосфат від З’- фосфату і т. п.

Ацилування

При дії на нуклеозиди ангідридів або хлорангидридів оцтової або бензойної кислот в безводному піридині в м’яких умовах добре ацилуються гідроксильні групи залишку вуглеводу. У разі цитидину, аміногрупа якого більш реакційноздатна, ніж у інших основ, ацилується також і аміногрупа. В реакціях ацилування первинні гідроксильні групи більш реакційноздатні, ніж вторинні.

Алкілування

З алкілувальних реагентів найбільш широке застосування мають трифенілхлорметан і його похідні, які селективно взаємодіють з пераїчними гідроксильними групами вуглеводневих залишків.

Реакції з карбонільними сполуками

Рибонуклеозиди, що містять незаміщені 2’- і З’-гідроксильні групи, в присутності кислотних каталізаторів легко вступають а реакцію з альдегідами і кетонами, утворюючи циклічні ацеталі або кеталі.

Окислення

Широке застосування а хімії нуклеїнових кислот має окислення цис-глікольної групи в рибонуклеозидах, оліго- і полірибонуклеотидів. Ця реакція проходить в м’яких умовах під дією солей йодної кислоти з утворенням діальдегіду. Такого роду діальдегіди досить реакційноздатні.

Розщеплення N-глікозидних зв’язків

N-глікозидні зв’язки нуклеозидів і нуклеотидів досить стійкі в нейтральному і лужному середовищах і розщеплюються при цих значеннях pH тільки в жорстких умовах. Однак вони відносно лабільні в кислому середовищі, що послужило основою перших методів визначення нуклеотидного складу нуклеїнових кислот (гідроліз хлорною кислотою протягом 1 год при 100 °С).

Розщеплення фосфоефірних зв’язків

Розщеплення фосфоефірних зв’язків може проходити з розривом С-О або Р-О зв’язків.

Основні хімічні реакції нуклеїнових кислот та їх компонентів дозволяють отримати уявлення про розмаїття хімічних перетворень, в яких беруть участь нуклеїнові кислоти in vivo та in vitro.

 

Читайте також:

 

Коментарі:

blog comments powered by Disqus